卡脖子！mRNA疫苗质量控制中不可缺少的关键原料！

全球十大突破性技术榜首--mRNA疫苗

2021年2月24日，《MIT Technology Review》发布了“全球十大突破性技术”名单，其中榜首即是mRNA疫苗。从2019年12月新冠爆发到2022年4月1号，全球新冠确诊已超4.8亿。新冠病毒的蔓延促进了mRNA疫苗的发展。mRNA疫苗在新冠疫苗开发方面的成功，也促进了其在各种传染病与肿瘤等治疗方面广阔的应用前景。

mRNA疫苗的生产流程包括序列设计、mRNA体外转录、体外修饰（加帽、加尾）、脂质体包被等过程。2020年发布的《预防用新型冠状病毒mRNA疫苗药学研究技术指导原则》中对mRNA的质量提出了一系列的要求，加帽率和加尾长度是其中最关键的2个指标。5’cap (5’帽)结构是翻译起始所必须的结构，为核糖体识别mRNA提供信号，并协助核糖体与mRNA结合使翻译从起始密码子开始。3’poly(A)（3’尾）可以控制mRNA的稳定性，以防降解，所以在mRNA合成修饰过程中，需要对5’加帽效率和3’poly(A)尾的分布进行监控。

图.1 mRNA的结构可以分为5个部分，

疫苗mRNA因为长度较大，为几千个核苷酸，而无法直接进行检测，因此需要将5’ cap和3’ poly(A)端酶切成短片段，酶切之后5’ cap和3’ poly(A)均可以通过纳米磁珠进行高通量、快速分离，这种纳米磁珠通常粒径在1-3μm之间。 

5’cap端检测流程

测定加帽效率主要是通过将5’cap端与生物素标记的引物退火，然后将5’cap端酶切成小片段，通过SA磁珠捕获出biotin标记部分，然后将5’cap从磁珠表面洗脱，通过毛细管凝胶电泳或质谱法进行检测（图2）。

3’ PolyA尾分布检测流程

3’ PolyA尾的检测方法与5’加帽效率的检测方法类似，需要通过酶切的方式获得3’端的Poly A尾短链，然后利用Oligo dT磁珠分离纯化，再分别进行毛细管电泳或质谱准确分析其长度分布（图3）。

在mRNA的5’端加帽效率和3’加尾分布的检测过程中，都需要磁珠进行mRNA片段的富集。磁珠的性能影响到整个检测数据的准确性和可靠性，该过程中的磁珠一般需要如下的特征：

a) 非特异性吸附低；

b) 灵敏度高，磁珠表面具有丰富的结合位点；

c) RNA易洗脱，磁珠表面需要特殊的封闭；

d) 耐受有机溶剂，部分操作会使用95%乙醇，对磁珠的溶剂耐受性有很大的要求。

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供稿：王艳芝     |    修订：彭颖静 


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Oligo dT 磁珠：https://www.biomart.cn/infosupply/104634079.htm

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